PRACTICA DE LABORATORIO

Disgregación de células, conteo en una suspensión y prueba de la viabilidad celular

La tripsinización es una técnica permite separar las células de su soporte mediante un enzima, la tripsina, que rompe las uniones de las células al soporte de un cultivo, así como las uniones entre las células de un tejido. Este proceso debe realizarse con cuidado ya que la tripsina también es capaz de destruir las células por digestión total. Cuando las células se hayan separado deben añadirse a una placa con medio o suero. En el suero hay moléculas que inhiben a la tripsina, parando la reacción impidiendo así la destrucción de las células.
El azul Tripán es una molécula coloreada de gran peso molecular que sólo es capaz de entrar en las células que tienen la membrana alterada. Por tanto una célula viva en perfecto estado se observará incolora mientras que una célula muerta o muy alterada se observará azul. De este modo se puede determinar la viabilidad celular, es decir, el número de células vivas dependiendo del número de células azules que vean en la cámara de Neubauer.
Materiales

- Medio RPMI
- Suero fetal bovino
- Tripsina
- Sangre
- 1 Cámara de Neubauer
- 1 Microscopio óptico de campo claro (objetivo X10)
- Suspensión de células con leucocitos
- Pipetas automáticas
- Pipetas pasteur
- Cubreobjetos para Cámara de Neubauer
- Solución de Azul de Tripán 0,25% (AT)
- Centrifuga
- Baño maría
- PBS
- Placas de microcultivo
- Puntas estériles
- Tubos ependorf de 1.5ml

MATERIALES NECESARIOS TRAIDOS POR GRUPOS:

1. Guantes estériles
2. Candela.
3. Toallas de cocina.
4. Marcador permanente punta fina.
5. Tapa bocas

Trabajar con todo el material estéril
Procedimiento Tripsinizacion
1. Preparar 1 ml de medio de cultivo celular RPMI suplementedo con suero fetal bovino al 10% y precalentarlo a 37ºC en baño maría
2. Precalentar la tripsina a 37ºC
3. Tomar 10 ml de sangre venosa en tubo seco y centrifugar a 2500rpm
4. Separar los leucocitos con pipeta pasteur o micropipeta
5. Colocar las células en las placas de cultivo (Figura 1) con 0.1 ml de medio de cultivo

Figura 1. Placas de microcultivo celular
6. Lavar las placas con 1 ml de PBS (tampón de fosfato y cloruro de sodio a pH 7.4)
7. Aspirar el PBS de las células con una pipeta Pasteur estéril
8. Añadir 0,1 ml de la solución de tripsina/EDTA estéril.
9. Seguir con el microscopio el proceso para comprobar la liberación de las células.
10. Dejar 5 minutos las placas en la incubadora.
11. Continuar mirando el proceso a través del microscopio.
12. Añadir 1 ml del medio RPMI + 10 % FBS (suero fetal bovino).
13. Dejar las placas en la incubadora.

Procedimiento medida de la viabilidad celular y conteo
1. Tomar 10 µl de la solución de células y añadir 90 µl de PBS.
2. Agitar las células con cuidado para asegurarse de la correcta disgregación.
3. Añadir una gota de la solución diluida de células a la cámara de Neubauer
4. Contar el número de células tal como se cuentan leucocitos
5. En un tubo de 1,5 ml poner 800 µl de PBS, 100 µl de la solución de azul tripan y 100 µl de la suspensión de células.
6. Agitar por inversión con cuidado y esperar un minuto.
7. Con la ayuda de la cámara de Neubauer calcular el porcentaje de la viabilidad celular.(Células blancas / células totales) x 100 = % viabilidad
Figura 2. Las células vivas se observan traslucidas